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　　ibidi µ-Slide y-shaped通道載玻片是研究內皮細胞對剪切應力反應的強大工具。本應用說明提供了一種簡化的方案：在µ-Slide y-shaped中培養人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），施加受控的剪切應力，并進行免疫熒光染色。在本示例中，我們用Cy5®對HUVEC上的von-Willebrand-Factor因子（vWF）進行染色，用Alexa Fluor 488®對分化分子簇31（CD31）進行間接染色，并用DAPI對細胞核進行復染。

　　該方案主要包含四個步驟：培養→固定→染色→成像

　　1. 培養

　　• 無菌條件下，打開µ-Slide y-shaped（貨號80126）置于µ-Slide rack載玻片支架（貨號80003），通道內注入200μl HUVEC細胞懸液（密度1×10?/ml），移除儲液池液體。

　　• 用隨附的蓋子蓋住儲液池口

　　• 將載玻片和載玻片支架架放入培養箱（37°C；5% CO?）中，讓細胞貼壁（約60分鐘）。之后，向兩個液池中各加入60µl無細胞培養基

　　• 繼續培養≥3小時/過夜

　　• 連接ibidi Pump System泵系統（含灌注套件+流體單元+氣壓泵），在培養箱（37°C；5% CO?）中進行流動培養。建議剪切力為7.5 dyne/cm²

　　• 使用11ml培養基時，需在3天內更換6ml培養基。

ibidi Pump System

　　2. 固定、透化和封閉

　　• 使用細胞培養吸液器吸除所有儲液池中的培養基。緩慢向一側儲液池中加入1000µl杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's PBS），同時從對側的儲液池中吸出液體，以此洗滌細胞。

　　注意：全程保持通道液體充盈，避免氣泡和細胞脫落）

　　• 用約150µl含2%多聚甲醛的PBS固定細胞。20分鐘后，向一側儲液池中加入約150µl含0.1% Triton® X-100（Fluka）的PBS，同時從對側的儲液池中吸出通道內的液體！確保通道始終保持濕潤！

　　• 按照上述方法，用1000µl含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗滌細胞。

　　3. 染色和封片

　　• 預先配制好抗體溶液（本方案使用的濃度為：DAPI 0.1µg/ml；抗vWF（兔源）（Sigma）和抗CD31（鼠源）（Sigma）按1:1000稀釋；抗兔（羊源）Cy5®（1mg/ml）（Invitrogen公司）按1:150稀釋；抗鼠（雞源）Alexa Fluor® 488（2mg/ml）（Invitrogen公司）按1:200稀釋）

　　• 將200µl含DAPI（Sigma）的PBS和1% BSA加入通道中，在室溫下孵育30分鐘

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗滌細胞兩次

　　• 將200µl含抗vWF（兔源）的PBS和1% BSA加入通道中，在室溫下孵育45分鐘

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗滌細胞兩次

　　• 將200µl含抗CD31（鼠源）的PBS和1% BSA加入通道中，在室溫下孵育45分鐘

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗滌細胞兩次

　　• 加入200µl 抗鼠（雞源）Alexa Fluor® 488，在室溫下孵育30分鐘

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗滌細胞兩次

　　• 加入200µl抗CD31（鼠源），在室溫下孵育30分鐘

　　• 洗滌細胞兩次

　　• 按照上述方法，用1000µl含1% BSA的PBS洗滌細胞，然后加入200µl甘油（80%的PBS溶液，添加2% DABCO）進行封片和防淬滅處理*。載玻片可保存約4周。

　　4. 固定、透化和封閉

　　• 在熒光顯微鏡下使用適當的濾光片組觀察細胞，并可選擇使用浸油。

　　HUVEC細胞；綠色：CD31（血小板內皮細胞黏附分子 - 1）；紅色：VIII因子（vWF）；藍色：細胞核DNA。（蔡司Axiovert 135; Plan-Neofluar 40x/0.75）

　　* 參考文獻：

　　Lee J.H., Koh H., Kim M., Kim Y., Lee S.Y., Karess R.E., Lee S.-H., Shong M., Kim J.- M., Kim J. & Chung J.; Energy-dependent regulation of cell structure by AMP-activated protein kinase. Nature Aug 2007; doi:10.1038/nature05828